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內(nèi)容概述：本研究提出了一種將Cas12bsgRNA 拆分為兩個(gè)片段（即“分裂 sgRNA”）的策略。該策略利用通用骨架結(jié)構(gòu)與可定制的 Spacer 區(qū)域相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì) Cas12b 切割活性的精確調(diào)控。同時(shí)，此方法支持無(wú)需核酸擴(kuò)增的 microRNA 直接檢測(cè)。研究結(jié)果表明，通過(guò)優(yōu)化 sgRNA 結(jié)構(gòu)可有效降低脫靶效應(yīng)并抑制背景切割信號(hào)，從而構(gòu)建了一個(gè)具有高靈敏度和高特異性的 microRNA 檢測(cè)平臺(tái)。

研究背景

在基因編輯和核酸檢測(cè)領(lǐng)域，Cas12b是一種極具潛力的 CRISPR-Cas 系統(tǒng)。然而，傳統(tǒng) sgRNA 設(shè)計(jì)易引發(fā)背景切割和脫靶效應(yīng)，需更精細(xì)的活性調(diào)控策略。同時(shí)，作為重要生物標(biāo)志物的 microRNA，其檢測(cè)面臨濃度低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等挑戰(zhàn)。為此，本研究旨在開(kāi)發(fā)一種新型 sgRNA 架構(gòu)，在實(shí)現(xiàn)對(duì) Cas12b 活性精準(zhǔn)調(diào)控的同時(shí)，支持無(wú)需擴(kuò)增的 microRNA 直接檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)方法與過(guò)程

• sgRNA 分裂設(shè)計(jì)：將 sgRNA 拆分為 scaffold 部分與 Spacer 部分分別表達(dá)或組裝。

• 活性調(diào)控評(píng)估：通過(guò)體外Cas12b 切割實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同組合，測(cè)定切割效率與背景活性。

• microRNA 檢測(cè)方案建立：結(jié)合報(bào)告片段和熒光信號(hào)輸出，無(wú)需逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增即可檢測(cè)目標(biāo) microRNA。

• 靈敏度與特異性測(cè)試：在多種microRNA 濃度梯度中測(cè)試檢測(cè)下限與選擇性。

  
  

Cas12b的sgRNA和分裂sgRNA的方案概述

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

• 活性調(diào)控：成功拆分sgRNA 顯著降低 Cas12b 的非特異背景切割，僅在配對(duì)正確 Spacer 后激活強(qiáng)信號(hào)。

• 高靈敏檢測(cè)：檢測(cè)下限達(dá)到picomolar 級(jí)別，背景噪音較低。

• microRNA 特異性良好：能區(qū)分近似序列差異較小的 microRNA，通過(guò) Spacer 定制即可切換檢測(cè)目標(biāo)。

  
  

結(jié)論

split sgRNA 的設(shè)計(jì)具備普適性，只需更換 Spacer 即可擴(kuò)展至不同 microRNA 或 DNA 靶標(biāo)，且無(wú)擴(kuò)增的檢測(cè)方法可以簡(jiǎn)化流程、降低成本與污染風(fēng)險(xiǎn)。該平臺(tái)具備潛力推廣至臨床快速診斷設(shè)備或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)（POCT）應(yīng)用。未來(lái)可與納米載體、光學(xué)傳感設(shè)備等結(jié)合，提升整體檢測(cè)便利性與應(yīng)用范圍。

使用改良的CRISPR-Cas12b 系統(tǒng)檢測(cè) miR-17、21、31 和 92a 的表達(dá)量

使用同樣的檢測(cè)方法檢測(cè)健康人（H.D.1–5）、結(jié)直腸癌患者術(shù)前（P.D.1–5 preO） 和 術(shù)后（P.D.1–5 postO） 血漿總 RNA 中的 miR-17、21、31 和 92a 水平

Cas12b split sgRNA 方法 與傳統(tǒng) RT-qPCR 方法對(duì)比

論文中用到的NEST產(chǎn)品

胎牛血清

實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)

涉及細(xì)胞類(lèi)型：HCT116,SW480, NCM460

在本實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用含FBS的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)了結(jié)直腸癌細(xì)胞系 HCT116、SW480 及正常腸上皮細(xì)胞系 NCM460，并從中提取 microRNA。隨后，他們利用開(kāi)發(fā)的 split sgRNA-Cas12b 方法檢測(cè)了 miR-17、miR-21、miR-31 和 miR-92a，并與傳統(tǒng) RT-qPCR 結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，癌細(xì)胞中 microRNA 表達(dá)量顯著高于正常細(xì)胞，兩種方法結(jié)果高度一致。此外，還檢測(cè)了結(jié)直腸癌患者術(shù)前術(shù)后及健康人群血漿中的 microRNA 水平，驗(yàn)證了其在腫瘤診斷和術(shù)后監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用潛力。

NEST胎牛血清的優(yōu)勢(shì)

NEST胎牛血清是從牛胎中抽取的血液凝固后剩余的液體部分，通過(guò)離心去除細(xì)胞、凝固纖維蛋白原和蛋白以得到血清，含有許多有助于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，包括：如生長(zhǎng)因子、附著因子、激素、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、脂質(zhì)、糖類(lèi)、維生素等。